Azure Sapphire™NIR-Q使多重Western blotting标准化变得轻而易举

现代数字检测仪器对于western blotting不仅仅是检测“有或没有”的技术，还可以进行western blotting重复性和定量的检测。在检测方法的线性动态范围，对数据进行标准化以控制蛋白上样量和膜转印带来的变化，可以获得真正的定量结果。 但是，对蛋白印迹进行标准化的**方法是什么？ 过去，金标准标准化方法是使用看家蛋白，基于这些蛋白在不同实验条件下和细胞系中表达一致的假设。 然而，*近的研究表明，这种假设并不总是正确的，导致相对蛋白丰度的测量结果不准确。 相反，定量Western blotting专家和他们发表的期刊正在推荐一种新的金标准用于标准化，总蛋白定量 - 通过在膜上染色，检测每个泳道的总蛋白进行标准化分析。

Azure Biosystems™的Sapphire™NIR-Q多功能激光生物分子成像系统具有两个用于近红外荧光检测（700nm和800nm）的通道和用于检测总蛋白专用的第三通道，使多重Western blotting标准化变得轻而易举。

您可以继续使用相同的NIR染料，同时加入总蛋白质染色剂，例如我们的低背景和易于使用的AzureRed试剂。 无需剥离和重孵育能够检测两种不同的蛋白和总蛋白信号。

> 定量更准确

> 检测更灵活

> 平台设计更灵活

> 模块化设计

使用看家蛋白进行标准化

使用看家蛋白**缺点是在样品间和不同条件下表达水平可能不一致。如使用看家蛋白进行标准化，必须先花费时间和精力来验证蛋白的选择，并且可能需要检查多种潜在的标准品，然后才能找到一种在所有样品中真正表达同一水平，并且在不同实验条件下不会发生变化的标准品。

使用看家蛋白的第二个重大挑战是它们的表达丰度很高，如果样品中的看家蛋白表达非常高，这会限制在凝胶上加载的样品量，因为需要保留看家蛋白在线性检测范围内并且不会使看家蛋白的信号饱和。 如果感兴趣的蛋白不是同样高度表达，这两种蛋白质不在同一线性检测范围内。

如果您正在进行多重蛋白印迹，例如比较同一蛋白质的磷酸化和非磷酸化形式，则需要考虑的第三个挑战是从不同物种中产生一抗和二抗的复杂性。

*后，检测的看家蛋白可能干扰感兴趣蛋白的检测。理想情况下，看家蛋白应该与感兴趣蛋白的大小不同，因此这两种蛋白可在印迹上空间分辨。 当实验在同一印迹上检查多种目的蛋白时，这变得越来越困难。

图1.与常见的看家蛋白相比，AzureRed具有更宽的线性动态范围

单色通道图像A）AzureRed染色总蛋白B）Tubulin C）β-action和D）GAPDH。 AzureRed信号的优异动态范围

与实际加载的蛋白量显示在图像（A）中。使用AzureSpot软件定量来自总蛋白和看家蛋白的信号，并将得到的值

相对于每个样品加载的蛋白量（E）作图。与常见的看家蛋白相比，AzureRed表现出更强的相关性和更广泛的动态范围。

使用总蛋白进行标准化

使用总蛋白标准化，不是试图找到可以代表转移到膜上的样品总量的蛋白，而是直接在膜上测量总蛋白，并且该值在标准化时用作分母。许多总蛋白染色剂可用于染色凝胶和膜。总蛋白染色提供更宽的动态范围，并且表现出比看家蛋白更低的可变性和更清楚的数据。

总蛋白标准化比使用看家蛋白质快得多，特别是对于化学发光印迹，因为相对于剥离和重孵育染色步骤花费较少的时间。 理想情况下，在免疫检测之前或之后，在膜上进行总蛋白染色。使用一些染色剂如AzureRed Fluorescent Total Protein Stain，可以在免疫检测前对印迹进行染色，然后与目的蛋白同时对总蛋白进行成像。 通过这种*简单的工作流程，目的蛋白和总蛋白的图像会自动对齐。

与使用看家蛋白相比，图像捕获后的分析工作流程基本不变；整个泳道或泳道中大部分信号用于标准化，而不是单一的条带。

用总蛋白染色剂对膜进行染色提供了额外的质控优势，可以验证转印是否完全。

使用AzureRed进行的总蛋白质标准化很容易适合任何蛋白质印迹工作流程