尽管不少同学与老师认为光谱流式无需像传统流式那样调节补偿，甚至可以使用光谱接近的荧光染料，从而在流式多色方案设计上可以随意搭配，然而，在实际尝试光谱流式细胞仪后，这种误解常常导致实验结果不理想。即使在光谱流式中，荧光染料的选择和搭配仍然需要经过精心设计和优化，以避免信号干扰和数据解读错误。因此，合理设计多色实验仍然是获得准确可靠结果的关键所在。

图1：补偿的定义：(a) 显示了使用PE标记抗体染色的人外周血单个核细胞（PBMCs）未经补偿（左图）和补偿后（右图）的数据。为了去除630/30滤光片中的PE信号，需要计算Y/X*100的比例。补偿后的数据展示了PE信号的扩散（spread）。(b) PE的发射谱图中展示了在(a)图中使用的两个滤光片。

无论采用哪种技术，免疫分型实验的成功都取决于对Spillover和Spread的正确理解和管理。这些概念对于实验结果的精准性至关重要。无论使用传统流式还是光谱流式，精心设计和优化荧光染料组合，合理应对这些关键挑战，仍然是获得可靠实验数据的关键步骤。

首先，让我们通过一个具体案例来深入理解Spread如何影响实验结果的准确性。

图2：扩散（spread）现象的重要性：人类外周血单个核细胞（PBMCs）被标记了Alexa Fluor 647标记的CD45RA，以及BV421、PE-CF594或PE-Cy5标记的CD4抗体。蓝色轮廓表示单色CD4染色细胞，红色轮廓显示了组合染色。图中显示双阳性群体在低扩散（spread）情况下能更好地与单阳性群体分离，尤其是来自仅染色CD4的细胞，这通过更高百分比得以显示。这说明扩散（spread）在数据分析中的重要性。

每种荧光染料的光谱都有可能部分重叠，即使在解混（unmix）过程中也难以完全避免这种干扰。如果不慎重选择荧光染料组合，特别是光谱接近的染料，可能会导致解混（unmix）后信号分离不完全，进而影响实验的准确性和可重复性。因此，无论使用的是传统流式还是光谱流式，精心设计和优化多色免疫分型方案，合理选择荧光染料组合，仍然是获得可靠实验结果的关键步骤。

图3：spread如何减弱信号的分离效果：在第一行（配色方案1），我们选择了不会在APC和PerCP-eFluor 710检测器中引起spread的荧光染料。尽管在CD4轴上有轻微但明显的分离（黑色箭头所示），TCRγδ单阳性和TCRγδ/CD3双阳性信号（红色箭头所示）的分离效果也相对良好。在第二行（配色方案2），我们使用了BV650（结合CD45），引入了APC检测器中的spread，并消除了配色方案1中看到的分离（黑色箭头）。此外，将结合CD3的荧光染料从BV605改为APC-R700后，在PerCP-eFluor 710检测器中引起了spread，导致了TCRγδ信号分离度变差（红色箭头）。

接下来我们进一步明确两者的概念：

Spillover（溢出）：

当荧光分子吸收光子时，会使电子跃迁至更高能级，随后释放出能量较低（波长较长）的光子。该光子在可见光谱范围内。流式细胞仪不仅测量主检测器中的荧光信号，还会在一个或多个次级检测器中检测到信号，这种现象被称为“Spillover（溢出）”。

Spread（扩散）：

Spillover（溢出）造成了真实信号识别的困难（光谱的重叠）。为了解决这个问题，传统流式使用补偿技术（compensation），光谱流式使用解混（unmix）技术。然而，在溢出效应时，数据的信号方差增加，会影响信号的区分和检测灵敏度。

为了更好地评估Spillover和Spread对实验结果的影响，我们需要使用一些专门的工具来对这两个现象进行量化分析。这些工具能够帮助我们深入探讨不同荧光染料在检测器中的行为，量化其对实验数据的潜在影响。通过使用这些工具，我们不仅可以更准确地设计实验，还能确保实验结果的可靠性和精确性。接下来，我们将详细介绍两个在量化这些现象时非常有用的工具，它们将在流式细胞术实验中发挥关键作用。

Spillover Spreading Matrix, SSM

（溢出扩散矩阵）

SSM 是一种定量工具，用于衡量每个荧光染料的信号在不同检测器中的扩散（spread）。它提供了各荧光染料之间相互影响的完整矩阵信息，帮助识别可能导致数据不准确的信号重叠。

Spread Quantification Index, SQI

（扩散量化指数）

SQI 是一个独立于荧光染料浓度和检测器类型的标准化指数，并且通过归一化，SQI值独立于检测器的电压/增益设置，使其在不同仪器和实验条件下具有可比性。作为评估荧光染料在多色流式细胞实验中的spread程度的工具，有助于优化实验设计，减少数据误差，提高结果的可重复性和准确性。

图4：SSM（溢出扩散（spread）矩阵） 和 SQI（扩散（spread）量化指数） 的概念与计算： (a)左图部分，首先计算Y轴上阳性和空白微球的标准差四分位数，并进行减法操作。此结果通过X轴上阳性和空白微球的中位数差进行归一化。所得结果为Intrinsic Spillover Spread (ISS)，这些数值显示在溢出扩散（spread）矩阵中。 (b)右图部分， 主要荧光染料X（在检测器A）向检测器B的溢出荧光导致了Y轴上的扩散（spread）。扩散（spread）的量化是Y轴上99百分位数和50百分位数之间的差异，并乘以归一化因子，使得SQI值独立于检测器增益设置。绿色线表示99百分位数的位置。

两个工具的的主要差异可以总结为下表：

在光谱流式的配色设计中，由于并不同于传统流式，荧光素对应某个荧光检测通道，每个检测通道都会收集所有荧光染料的信号，再通过光谱解混（unmix）来分离重叠的光谱，因此需要额外的工具来优化配色方案。

Complexity Index（复杂性指数）

用于评估信号混杂和解混（unmix）的复杂程度，帮助选择较优的荧光组合，以减少复杂性，确保多色实验的有效性。

Similarity Matrix（相似性矩阵）

用于衡量荧光染料之间的光谱重叠程度，避免选用光谱过于接近的染料组合，从而减少解混（unmix）误差，提高实验精度。

图5：FluoroFinder 根据光谱流式细胞仪的配置和所选荧光染料生成参考Similarity Matrix（相似性矩阵） 和参考 Complexity Index（复杂性指数）。这些工具帮助用户评估荧光染料之间的光谱重叠程度，并评估信号混杂和解混（unmix）的复杂性。通过使用这些指标，研究人员可以优化多色配色方案，选择最佳荧光组合，减少解混（unmix）误差，确保实验数据的准确性和可靠性。在同型号的不同配置仪器，对于同样的荧光素组合，其参考矩阵不同，且参考Complexity Index（复杂性指数）也不同。

通过精准掌握Spillover和Spread的概念，以及巧妙运用SSM、SQI、Complexity Index和Similarity Matrix等工具，您不仅能在传统流式细胞术中应对复杂的多色实验设计，还能在光谱流式中游刃有余。这样，您的实验数据将更加可靠和高效。

CytoFLEX 系列流式细胞仪凭借其创新的雪崩光电二极管（APD）检测器和卓越的光学设计，实现了更低的SQI（Spread Quantification Index）。APD 检测器具有更高的灵敏度和更低的噪声水平，能够更精确地捕捉微弱的荧光信号。这种设计减少了信号扩散（spread）和溢出效应，使得实验结果更加稳定和精确。卓越的光学系统进一步优化了信号检测路径，确保了数据的高质量和可重复性，是多色流式细胞实验的理想选择。

图6：四种不同流式细胞仪中比较spread现象；使用不同的单染色微球集群在四种不同仪器上运行。对每种组合计算了SQI值。SQI值按以下范围分类：1-120（绿色）；121-199（黄色）；200-299（橙色）；和300以上（红色）。

CytoFLEX流式细胞仪的补偿库设计极大地提升了多色实验的准确性和效率。通过预先建立和存储多种荧光染料组合的补偿设置，研究人员能够快速应用适合的补偿参数，减少手动调整的时间和误差。这不仅简化了复杂的实验设计过程，还确保了在多色分析中获得一致且可靠的结果，从而使得实验更加精确和高效。

图7：CytoFLEX流式细胞仪在多色实验中的补偿调节工作流程。CytoFLEX通过其先进的补偿库设计，使实验过程更加高效和精准。用户仅需设定通道电压或增益并收集单染管数据，系统便会自动计算补偿矩阵。在获得补偿库后，若需要调整，CytoFLEX能够智能调整增益和电压，重新计算补偿，无需重复实验步骤。相比传统方法，CytoFLEX的这一创新设计减少了实验误差，大幅提升了实验的可重复性和效率，为研究人员提供了更强大的实验支持。

在科学研究中，概念与方法是实验设计的基石，而先进的技术则是实现这一切的驱动力。CytoFLEX流式细胞仪以其卓越的光学设计和智能化的补偿库，为多色实验带来了前所未有的精确性和效率。科技不仅是工具，更是未来的指引者，推动着我们在探索未知的道路上不断前行。让技术与科学相结合，共同演绎出未来的无限可能。 

● 文章来源：

 Bhowmick, Debajit, and Timothy P. Bushnell. "How to Measure “Spillover Spread”." *Flow Cytometry Protocols*. New York, NY: Springer US, 2024. 69-83.Ferrer-Font, Laura, et al. "Panel Design and Optimization for Full Spectrum Flow Cytometry." *Flow Cytometry Protocols*. New York, NY: Springer US, 2024. 99-124.Zargaran, Sina, et al. "Practical 10‐Color T‐Cell Panel for Phenotyping Diverse Populations Using Spectral Flow Cytometry: A Beginner's Guide." *Current Protocols* 4.3 (2024): e1020.Ferrer‐Font, Laura, et al. "Panel optimization for high‐dimensional immunophenotyping assays using full‐spectrum flow cytometry." *Current Protocols* 1.9 (2021): e222.Bhowmick, Debajit, et al. "A gain and dynamic range independent index to quantify spillover spread to aid panel design in flow cytometry." *Scientific Reports* 11.1 (2021): 20553.Park, Lily M., Joanne Lannigan, and Maria C. Jaimes. "OMIP‐069: forty‐color full spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of major cell subsets in human peripheral blood." *Cytometry Part A* 97.10 (2020): 1044-1051.Nguyen, Richard, et al. "Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design." *Cytometry Part A* 83.3 (2013): 306-315.Roederer, Mario. "Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats." *Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology* 45.3 (2001): 194-205.