根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IACR）发布的2020年全球最新癌症负担数据，仅2020年中国新发癌症病例就高达457万例，死亡病例300万例，两项数据皆高居全球第一。继手术、放疗、化疗以后，细胞治疗被称为第四种肿瘤疗法，2013年甚至被Science评为年度最有价值的科学突破之一，可以说21世纪是细胞治疗的时代。

《Nature Reviews Drug Discovery》上发表的全球癌症免疫疗法分析表示，截止2021年4月16日，全球在研的活细胞治疗药物共计有2073种，其中CAR-T细胞疗法新增的临床管线高达到299条，新增幅度达到35%，在免疫细胞疗法中名列前茅。中国和美国CAR-T细胞疗法研发临床试验项目远高于其他国家。据不完全统计，2020年，中国正在进行的临床阶段的CAR-T疗法为36款，共计三百多个相关临床项目在研。

什么是细胞培养？

细胞培养是指从动物或植物中提取细胞，然后在人工环境中进行培养以进行科学研究。最早的细胞培养技术是在100多年前开发的，为科学的巨大突破做出了贡献。如今，它已成为全世界实验室用于研究细胞的生理学、生物化学、疾病潜在机制以及药物和有毒化合物的作用的基本工具。它也可用于在药物筛选和大规模制造生物化合物，诸如疫苗和治疗性蛋白质。

 细胞所需的基本设备和试剂

要进行需要细胞培养工作的研究并进行基本的细胞培养方案，下表1和表2汇总了一些关键设备和一些基本试剂。

细胞培养所需的基本试剂

其他设备包括在层流罩中的抽吸泵，可轻松地从细胞培养容器中去除培养基和试剂；用于对设备和可重复使用玻璃器皿进行消毒的高压灭菌器；注射器，针头和镊子；计时器 、75％乙醇喷雾瓶和纸巾卷，用于对表面和设备进行消毒；胶带和用于标记的永久性标记记号笔；管架和废物箱等。

细胞培养所需的基本试剂

 细胞培养基础

对于细胞存活和生长，至关重要的是培养环境尽可能复制细胞的生理环境。可以控制的培养条件包括温度、相对湿度和二氧化碳含量，以及与培养基相关的因素，例如营养成分、pH、分子渗透摩尔浓度以及补料的体积和使用频率。这些变量会随时间波动，因此应对其 进行监视。下表3突出显示了大多数哺乳动物细胞培养的最佳培养条件，但有些细胞确实存在例外。

大多数哺乳动物细胞的最佳细胞培养条件

原代细胞与永生细胞

原代细胞培养是直接从完整或分离的组织或器官片段中分离并在培养皿中生长的细胞。首次将原代培养物进行传代培养后，它就被称为细胞系。原代细胞系的寿命有限，在达到衰老状态（细胞分裂停止）之前只能传代培养10至20次。

一些细胞系的寿命没有限制，并且具有无限的增殖能力。这些细胞系被称为连续的或永生的细胞系。细胞的永生化可以多种方式发生。癌细胞具有固有的突变，使细胞能够不受限制地繁殖。最初具有有限寿命的正常细胞可以通过促进生长的基因突变而转化为永生化细胞。通过化学处理或引入可激活生长促进基因的致瘤病毒，也可使在培养物中生长的正常细胞永生。下图1显示了从原代到转化后连续细胞系的进化以及每个阶段的理论细胞产量。

原代细胞到连续细胞系的进化和理论细胞产量

 细胞培养冷冻保存和复苏

细胞系是宝贵的资源，因此保存库存以进行长期存储至关重要。冷冻保存是指在非常低的温度下冷却和保存细胞以保持其生存能力的过程。细胞库适合在低于-130°C的温度下长期保存。

冷冻保存培养细胞的最佳方法是在冷冻保护剂（例如DMSO）存在的情况下，将它们保存在完全培养基中的液氮中。防冻剂降低培养基的凝固点，还可以降低冷却速度，从而大大降低形成冰晶的风险，而冰晶可能损坏细胞并导致细胞死亡。细胞应以高浓度（例如90％融合时）和最早的传代次数进行冷冻保存。简而言之，冷冻保存包括洗涤和沉淀细胞，将其重悬于含有DMSO（例如5％DMSO）的完全培养基中，并将细胞悬浮液转移至1mL无菌冷冻管中。由于细胞必须缓慢冷冻，因此将冷冻管放置在可控速率的冷冻室或冷冻室中。将冷冻冷冻的容器在-50至-80°C的温度下储存24小时，然后将冷冻管转移到液氮储存器中。

确切的冷冻条件取决于使用的细胞系。检查特定于细胞系的条件非常重要，否则冷冻的种子细胞在复苏和再培养时可能不会产生活细胞。

为了从液氮储存中恢复细胞系，将冷冻的小瓶在便携式液氮容器或干冰中运输到细胞培养区域。冷冻小管中的DMSO一旦融化，会对细胞产生毒性，因此，为确保高细胞活力，必须在37°C水浴中迅速融化细胞，并立即将其转移到装有预热培养基的培养皿中。培养基稀释了DMSO，因此细胞不再处于有毒浓度。一旦复苏的细胞繁殖并传代两次，它们就可以用于实验。比较好的法是尽快冷冻储存更多细胞，并更换长期存储的细胞。

细胞治疗产品生产

过程中的污染控制建议

在细胞治疗产品（如CAR-T细胞）生产过程中，鉴于供体的可变性及可能含有传染性疾病的病原体，且培养过程易导致污染，故尤其关注防止颗粒及微生物污染。特别是在细胞治疗产品上游的关键工艺，在设计工艺流程时，建议设计一个封闭的、或功能封闭的制造过程，以降低产品污染的风险。在细胞治疗产品的整个生产过程中，对洁净环境的控制、一次性系统的使用、对生产及培养设备的选择等更是有着严格的合规要求。

 摒弃型工艺解决方案

首先，可选择使用抛弃型工艺解决方案，可以降低微生物污染和交叉污染的风险，满足无菌化的要求。直接接触细胞治疗产品的无菌耗材应当尽可能使用一次性材料，并且所使用的耗材必须要经过严格的筛选，在开展耗材适用性和生物安全性评估，以及基于风险评估开展充分的耗材相容性和密封性的研究后，才能投入生产中使用。

 生产及培养设备污染防控

再者，对于生产及培养设备来说，更加需要严格把关。比如设备的外表面应易清洁，尽量没有清洁死角，同时耐受消毒剂及灭菌剂；其次，设备使用时应兼具产品及使用者的生物安全需求；最后设备运行过程和操作过程中，应降低甚至避免对洁净室的洁净环境的影响，确保生产环境符合要求。

 生产及培养设备污染防控

置于产品生产环境中的CO2培养箱，可以为细胞提供稳定的培养环境条件，保障产品的质量。培养箱的开关门及排风均会对其放置的周边洁净环境有一定影响，建议在前端设备选型时注意，并在设备进入到使用环境后注意维护及控制，从而保证设备不会对外部洁净环境造成破坏。特别注意的是培养箱内部的环境建议等同于B级洁净环境，使得开闭门时内外洁净级别一致，同时设备运行过程散发的排风颗粒应在硬件设计上有所控制，使其满足使用环境的需求。

BINDER为CRT细胞治疗再添解决方案

自动可规模化、功能性封闭的新一代细胞制造工艺是未来发展趋势，德国宾德为CRT细胞治疗再添新方案。

BINDER CBF 是带湿度调节功能的高端二氧化碳培养箱，适用于 GxP 环境中的所有敏感培养任务。即使是基于细胞并用多孔板进行的检测，该产品也确保能够获得一致的结果。即使是在缺氧条件下的复杂培养环境或个性化生长环境，BINDER 培养箱凭借其丰富的选购件和附件产品也可轻松胜任。

基于现有的CBF系列，宾德针对细胞治疗等特定用户群推出了一款全新的蜂巢版CBF，该版本产品适用于细胞治疗、基因治疗或干细胞研究等有严苛要求的应用场景。其为专供“细胞治疗”的特别版本 CBF 260。此版本配置与配备 O2 控制系统的 CBF 260 相同，可选配8段分隔内门。可以实现对细胞进行有效的分区管理，已降低培养环境对细胞的负面影响。并对潜在污染进行有效地控制。

该版本 CBF 260可监控四个参数 ：温度、CO2 浓度和氧气浓度以及相对湿度。其中湿度控制尤为重要，培养箱在开门后几分钟内即可恢复理想的湿度环境，从而避免培养介质发生不必要的蒸发。

从灵活性中获益！

除了固定配置以外，所有 CB 和 CBF 型号产品均可灵活配置这款全新选购件“带细胞治疗分隔区的分隔式内门”：无论是否配置湿度控制或 O2 控制的设备，亦或是尺寸型号为 56、170 或者 260 的产品均可选用。