3D Nanoimaging

三维纳米成像（3D Nanoimaging）和单分子跟踪系统（升级Olympus 共焦显微镜）

Overview

在过去的几年里，人们已经设计了几种方法来使用光学显微镜（STED，PALM，STORM）获得具有纳米分辨率的细胞特征图像。这些方法虽然功能强大，但在检测图像中稀疏的纳米结构时效率很低。同时，它们也不足以探测纳米级三维结构中亚秒级的化学反应动力学，这些结构是不断移动和改变形状的。

在纳米成像方法达到超分辨率的情况下，激光束不会像光栅图像那样按照预定的模式扫描样品。相反，激光扫描成像基于反馈算法，在扫描过程中，根据待成像物体的形状连续地调整和确定激光束跟随的路径。该算法将激光光斑移动到离物体表面一定距离的位置，由于激光光斑的位置和离物体表面的距离是已知的参数，所以利用这些参数来重建物体的形状。

三维细胞结构可以在几秒钟内分辨率达到20-40纳米，精度为2纳米。

How it work?

使用SMT（Single-Molecule Tracking）纳米成像的操作顺序很简单：首先，获取感兴趣区域的共焦图像；然后，用户识别要成像的对象。SMT纳米成像通过开关激活，激光束位于距离物体中心100-200纳米的位置。当激光光斑接近待成像表面时，荧光量增加。然而，荧光强度的增加取决于距离以及荧光团的浓度和它们各自的量子产率。为了将距离效应与浓度效应分开，点的位置被迫垂直于表面振荡。也就是说，荧光强度在振荡过程中发生变化（图1）。

Figure 1. 调制跟踪技术示意图。束点围绕物体以圆形轨道运动，其与物体表面的距离以设定的频率周期性地变化；通常，对于每个轨道，振荡次数在8到32之间，取决于物体的大小。这些半径的小振荡被用来计算轨道的调制函数，从中可以确定光斑与表面的距离。

调制函数定义为由于表面的局部荧光而使交替部分与平均部分之比。实际上，调制是PSF的空间导数与强度的比值。调制函数随着离表面距离的函数呈准线性增加，这一特性允许它用于确定沿轨道激光光斑离表面的距离。通过这种方法，计算并重建物体的横向形状。

下面是纳米成像单元及其与FV1000共焦显微镜的连接示意图。开关盒允许用户在标准操作模式下操作FV1000，或激活纳米成像系统。在纳米成像操作中，FV1000的振镜通过国际空间站提供的电子设备进行控制。该信号由FV1000的内部探测器收集并转移到ISS光子计数数据采集单元。使用FV1000的振镜在XY平面上跟踪分子，并通过压电控制级在z轴上跟踪分子。仪表控制、数据采集和显示在单独的计算机上完成。

右侧部分包括仪器组件（PC、控制电子设备、扫描仪和激光发射器）。示意图的左侧部分包括ISS随升级包提供的组件.

可参看文献：

Nanometer-scale Imaging by the Modulation Tracking Method

Lanzano， L.， Digman， M.A.， Fwu， P.， Giral， H.， Levi， M.， Gratton， E.

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Measurement of Distance with the Nanoscale Precise Imaging by Rapid Beam Oscillation Method

Lanzano， L.， Gratton， E.

Microsc Res Tech， 2012， 75(9)， 1253-64.

Real-time Multi-Parameter Spectroscopy and Localization in Three-Dimensional Single-Particle Tracking

Hellriegel， C.， Gratton， E.

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Real-time Nanomicroscopy Via Three-Dimensional Single Particle Tracking

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Distance Measurement by Circular Scanning of the Excitation Beam in the Two-Photon Microscope

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