操作流程 3

安全预防

• 当使用 qEV 柱时采取适当的个人防护措施，比如实验服，手套和防护镜。

• 柱子的抗菌溶液包含 0.05% w/v 的叠氮化钠。大量的叠氮化钠有毒，所以应该避免皮肤和眼睛的直接接触。

• 废弃缓冲液应妥善处理。叠氮化钠会在铜制管道中累积引起爆炸。

• 生物样品可能有危险，当使用 qEV 柱时，请教实验室安全员有关样品安全操作的要点。

保存

柱子保存在含有抑菌剂（例如 20 %乙醇，或<0.05 % w/v 的叠氮化钠）的溶液中，存放于+4到+8 °C。抑菌剂可以在冲洗步骤时引入（见囊泡收集后部分）。

使用前

如下图所示：

• 将柱子固定，使液面水平（确保柱子垂直）

• 不要移除底部滑动盖

• 小心缓慢地移去顶盖

柱子的平衡

• 移除底部滑动盖，并且使用至少 10 mL 洗脱缓冲液（PBS）冲洗柱子。如果不是使用PBS 洗脱，那么至少使用 30 mL 洗脱缓冲液冲洗柱子。记下 5 ml 缓冲液通过尺寸排阻柱通过的时间，这可用于判断何时需要清洗柱子。

• 确认有充分的平衡时间使柱子温度介于操作温度范围内。

• 不要使柱子变干。顶部的筛板必须保持湿润。柱子变干会影响其功能。

• 使用当天新配的过滤（0.2 μm）缓冲液避免引入颗粒物污染。

• 为了**的结果，建议购买 Izon Prep and Reagent 试剂盒。

• 如果在操作温度范围之外使用，可能会得到错误的结果。

样品的纯化

一.样品的引入的应用

1. 在柱子移除底部滑动盖之前，用移液枪移除筛板顶部的缓冲液。

2. 加入 500 μL 样品。

3. 立即移去底部滑动盖。

4. 立即开始收集 0.5 mL 馏分；

• *开始的六个馏分（3.0 mL）是空隙体积，不包含囊泡，通常无需分析。

• 建议将空隙体积收集在同一个收集管中来节约时间，并可避免 6 个单独的管子带来的测量误差。

5. 当*后的样品刚刚进入柱子顶部筛板（与之相平），加入更多的缓冲液，但是不要高于顶部筛板 2 mL。

• 等待直到*后一滴样品刚刚进入柱子顶部筛板，避免样品稀释。

二. 样品馏分收集

当依据操作流程使用 qEV 柱时，EVs 大多数洗脱于馏分 7、8 和 9 中，去除了～99.8 %的蛋白；

大于 10 的馏分包含更多的蛋白和更少的囊泡，不建议分析。为了得到更高的 EV 回收率，馏分可以合并起来，但是，合并馏分会稀释 EVs 的浓度。

方法 A — 得到**的纯度和浓度

不同的样品会得到不同的洗脱峰形，因此建议预先测量 EV 浓度并对所有馏分（7 - 11）进行蛋白纯化。

1. 空隙体积之后立即收集 3 个囊泡馏分，每个馏分 500 μL（馏分 7、8 和 9）。

2. 测量每个馏分的 EV 浓度（使用 Izon qNano）和蛋白纯度。

• 为了得到高浓度囊泡，使用** EV 浓度的馏分（通常 7 和 8）。注意：合并馏分会稀释 EV 浓度。

• 为了得到高纯度囊泡，使用*低蛋白浓度的馏分。

方法 B — 一般使用操作

空隙体积之后立即收集一个囊泡馏分，1500μL。为了减少蛋白污染，建议只收集 1000 μL。

三. 囊泡收集后

当收集完囊泡馏分之后，用至少 10 mL 缓冲液冲洗柱子，并按照《保存》部分的要求保存柱子。记下 5 ml 缓冲液通过尺寸流过尺寸排阻柱所需要的时间，这对于检测何时清洗柱子很有用。流速的改变可能暗示柱子被堵住或被污染。

qEV 柱的维护

再次使用

如何检测柱子何时被污染并需要清洁；

• 流速相比初始流速开始变缓。因此建议测量初始冲洗流速（和／或空隙体积）作为对比。

• 如果较先前相似的样品来说回收率明显下降，那么期望的 EVs 产率也相应下降。如果是这样，使用 Izon CPC100 校正颗粒（稀释于 PBS 缓冲溶液中），收集馏分并使用qNano 测量至少 2000 个数。两个峰值馏分的回收率应该>50%。

• 在冲洗完后，柱子顶端有颜色的变化。

注意

• 对于新的柱子和干净或再生的柱子，顶盖和凝胶表面之间的空间说明储存过程当中凝胶有所沉降，并不影响其性能。为了使

样品的稀释影响*小化，可以将顶盖向下推动<2 mm。

• 当囊泡馏分随后被用于 PCR 或 RT-PCR 时，建议柱子单次使用。

柱子的再生

通常使用 20 到 30 mL 缓冲液清洗柱子，随后使用新缓冲液平衡柱子（如果更换环境）。在一些应用中，变性的蛋白或脂质不会在再生步骤中被洗脱下来。可以通过下面的清洗步骤来去除。

柱子的清洗

去除沉淀蛋白、非特异性吸附蛋白和脂蛋白用 10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子，然后用至少 30到 50 mL 缓冲液冲洗柱子，并检查洗脱溶液pH。

去除强非特异性吸附蛋白、脂蛋白和脂质

用 20 mL 非离子型表面活性剂溶液，如 0.1 %Triton X-100 清洗柱子，然后用至少 20 到 30mL 缓冲液冲洗柱子。

在某些情况下，一些样品仍会残留痕量蛋白。在清洗结束时再次检查蛋白含量，如果蛋白水平高于预期，再清洗一次。

柱子的消毒

消毒可以**程度减少凝胶的微生物污染。用10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子。然后用 30 到 50mL 无菌缓冲液平衡柱子，并检查洗脱溶液pH。

注意

• 脱气缓冲液有助于避免凝胶基质中气泡的产生。少量的气泡（<10）对柱效影响极小。

• 建议使用 0.15 M 或更高离子强度的缓冲液，以避免溶质与凝胶基质之间产生不必要的离子相互作用。

• 为了避免尺寸排阻柱的堵塞，建议过滤或低速离心生物样品以去除大颗粒物。

柱子的性能指标

囊泡的峰值洗脱

• 对于 500 μL 的样品体积，囊泡的洗脱峰值在 4.0 mL ± 0.5 mL。

• 两个峰值馏分的回收率大约 50 %。

• 对于 500 μL 的样品，峰值馏分通常在馏分 8 和 9 之中。如果希望更高的纯度，可以只收集*早的峰值馏分。

通过测定 280 nm 处的紫外吸收可以得到 qEV柱的蛋白洗脱图。通过 Bradford 法可以准确测定每个馏分中蛋白的精确含量。图 1 展示了当500 μL 血浆样品上样至柱上时的囊泡洗脱图。每个馏分的囊泡浓度通过 qNano 测量，蛋白含量通过 280 nm 处的吸收值来测量。

囊泡的富集是十分明显，它们主要存在于馏分7、8 和 9 中。血清蛋白的洗脱更慢一些，主要存在于馏分 11 - 30 中。大于 10 的馏分通常含有高浓度的蛋白和低浓度的囊泡，不建议用来做分析。

EVs 的洗脱始于馏分 7，馏分 8 和 9 的浓度达到**。收集越多的馏分，EVs 的总回收率越高。

图 2 血浆中 EVs 的回收率说明了这点。但是，收集的馏分越多，EV 的回收浓度就会越稀释。见表 1。

上样体积

上样体积越大，囊泡馏分中的囊泡纯度越低。图 3 展示了血清上样体积为 100 μL，500 μL 和2000 μL 时的囊泡分布。2000 μL 的样品导致囊泡**程度地被蛋白污染。2000 μL 样品中外泌体的出峰延迟显而易见。

为了得到更纯的 qEV，建议**的样品体积为100 μL 至 500 μL，这样囊泡会洗脱于馏分 7 至9 之中。

图 4 展示了血清上样体积为 100 μL 和 500 μL 时的囊泡洗脱图。

囊泡的损失发生在当样品体积大于 500 μL 时，囊泡的洗脱峰很宽以至于一些囊泡从馏分 11中被洗脱下来。这些馏分不建议用来分析因为包含了大量的干扰蛋白。

纯化

图 5 展示了馏分 7 到 9 之间含有很少量的蛋白，且越后面的馏分中蛋白含量越多。

图 6 展示了经过 qEV 柱纯化后，EVs 相对于蛋白的纯化度。每个馏分的纯化因子（纯化前后蛋白的减少比例）如图所示。馏分 7 和 8 富集的 EVs *多，也就是相对于回收的囊泡来说大部分蛋白被除去。

qEV 柱纯化过程中的稀释

为研究 qEV 纯化过程中对样本的稀释，用已知浓度的聚苯乙烯纳米颗粒标准品和脂质体来模拟 EVs 的尺寸和组成。

稀释因子取决于哪些馏分被合并起来。起始体积为 500 μL 的聚苯乙烯纳米颗粒标准品（直径众数为 400 nm）的总回收率为～100%。

图 7 说明合并馏分 5 至 11 可以得到 100%的颗粒回收率。这导致稀释因子为 7，并且收集的馏分含有大量的干扰蛋白，因此不适于实际应用。

表 1 展示了收集不同馏分的稀释因子以及回收率。

虽然可以获得 100％的回收率，但是也可以通过测量每一个馏分的颗粒浓度，将浓度**的两个馏分合并起来。因此回收率与纯度之间存在折衷。当将馏分 7 和 8 合并起来时，脂质体实验的回收率为～50 %，与聚苯乙烯纳米颗粒的结果相一致。

依据 EVs 的*终浓度，可以不稀释馏分，直接用 qNano 来测量每个 馏 分 的浓度。对于qNano，每分钟 500 到 1600 个颗粒是**速率。如果样品速率高于这个范围则需要进行稀释。

如果依据这个操作步骤来使用 qEV 柱，并且每个馏分的体积很精确的话，EVs 会始终洗脱于馏分 7、8 和 9，而馏分 10 和 11 中的含量很少。

操作温度

qEV 柱经过严格的质量控制，流速大约 1 毫升/分钟（±0.2 毫升/分钟）。对于一些样品来说，操作温度可能会影响流速，*终影响 EVs的洗脱峰形。

回收率的优化温度为在 15 °C 和 25 °C 之间 ，因此推荐的操作温度为 15 - 25 °C 。

大体积样品的操作 4

对于一些生物流体来说， qEV 纯化前，可以通过将样品预先浓缩来获得更多的外泌体。根据所使用的样品和其它制备步骤，此操作步骤可以根据需要相应修改。

1）取定量的细胞培养液，将样品离心 1500 g，10 分钟，随后离心 3000 g，10 分钟，取上清液。对于细菌细胞来说，则需要更高的离心力。

2）用 Merck Millipore 离心装置或等同的装置来浓缩细胞培养液。Amicon Ultra 15 是一种 50mL Falcon 类型装置，需要很低的离心转速，*高 4000 g。这样的话每次离心需要 15 分钟。这个装置可以将 15 mL 液体浓缩至 300-500 μL。

3）如果样品中含有不溶物，在 qEV 纯化前10，000 g 离心 10 分钟，去除沉淀。否则这些沉淀会对后续 TRPS 分析造成影响。

4）样品经过以上浓缩便可以按照上面第二部分来进行 qEV 纯化了。样品馏分收集见第 2 页。

qEV 馏分的 TRPS 分析

对于 TRPS 分析来说，Izon Science 推荐使用Izon 试剂盒，这个试剂盒可以用来预涂纳米孔并可以在整个操作过程中使用。

在 TRPS 的准备阶段和操作阶段中，需要过滤所有试剂以避免污染或者大颗粒对 TRPS 浓度测试的干扰。Izon Science 推荐使用当天新配的过膜（0.22 μm 注射器式滤器）试剂。

用 TRPS 分析 qEV 馏分时，Izon Science 推荐将馏分在初始电解液稀释 1/5 或 1/10。优化稀释比例，使得**压力下的通过速率为约每分钟500-1600 个颗粒，以避免纳米孔堵塞。

如果对于 TRPS 分析来说囊泡浓度过低，需要浓缩样品（见下面）。下面部分介绍 qEV 馏分收集后的样品浓缩。

qEV 馏分收集后的样品浓缩

对于小体积样品或对于少 EVs 的样品来说，浓缩囊泡可以使分析变得更简单。下面的方法可以在 0.5 - 1 h 之内浓缩收集到的囊泡。

通过 Merck Millipore Microcon-30 装置浓缩小体积样品（需要实验室离心机达到 14，000 g 的离心力）。可以将 0.5 mL 样品浓缩至大约 200μL。可以重复浓缩获得更多的样品（比如馏分7-9）。

术语表

色谱：一种样品中成分分离的方法。由固定相和流动相组成，样品的各组分在两相之间分配。固定相可以是固体，固体支持液体或凝胶。固定相可被填充在柱中，伸展为固定层或分布为薄膜。流动相可以是气体或液体。

柱体积：填充材料和空隙体积的体积和（可简称为床体积）。

馏分：表示从柱上收集的特定体积，对于给定体积数值恒定。也就是说，馏分 7 的 0.5 毫升是指收集的 3.0 毫升至3.5 毫升中的 0.5 毫升。

脱气：指将溶液抽真空来“煮”掉多余的溶解气体，如将烧瓶抽真空。

流速：载液的体积流量，单位为 mL / min。

空隙体积：柱中固定相的总体积；柱子的其余部分由凝胶材料填充。它表示了 SEC 的排除体积。

囊泡馏分：囊泡出现在的馏分。

回收率：囊泡从柱子流出的量与进入柱子的量的百分比。